Mengenal Kromatografi dan HPLC

Kromatografi adalah salah satu teknik pemisahan dan pemurnian suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusinya terhadap fase gerak dan fase diam. Dengan metode kromatografi, hampir setiap campuran kimia mulai dari berat molekul rendah sampai tinggi, dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya (Gritter et al., 1991).
Macam kromatografi yang dapat digunakan untuk memisahkan campuran zat-zat kimia yang terkandung dalam tumbuhan antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (Harborne, 1987).
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan suatu senyawa dari campurannya karena perbedaan keseimbangan distribusi senyawa diantara 2 fase yaitu fase diam dan fase gerak (koefisien distribusi). Migrasi suatu senyawa hanya terjadi apabila senyawa trsebut dalam fase gerak, sehingga kecepatan migrasi senyawa proporsional terhadap koefisien distribusinya. Senyawa dengan distribusi yang tinggi pada fase diam akan bergerak lebih lambat dalam kolom dan terpisah dari senyawa dengan distribusi rendah pada fase diam (Hamilton et al., 1982; Sastrohamidjojo, 2001).
Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak/mobil. Fasa diam berupa padatan/cair yang dilapiskan pada padatan/gel. Pada pemisahan ini senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang bergerak mengalir melalui suatu sistem yang diam, dan selama pengaliran fasa mobil akan terjadi pelarutan, adsorpsi, dan penguapan. Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaan-perbedaan sifat-sifat fisik komponen yang hendak dipisahkan (Mulja, 1995). Perbedaaan sifat tersebut diantaranya :

1. Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut
2. Sifat untuk bertaut (adsorpsi) yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk bahan padat
3. Sifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain.

Berdasarkan asas terjadinya proses pemisahan maka kromatografi dibedakan menjadi 4  (Mulja, 1995), yaitu :

1. Kromatografi dengan asas adsorpsi.

Kromatografi jenis ini menggunakan fasa diam padat dan fasa gerak cair atau gas. Pemisahan komponen-komponennya akan sangat bergantung pada   perbedaan polaritas molekul-molekul yang akan dipisahkan.

1. Kromatografi dengan asas partisi.

Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan komponen-komponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi) molekul-molekul yang dipisahkan.

1. Kromatografi dengan asas filtrasi.

Kromatografi jenis ini memakai fasa padat yang mempunyai sifat filtrasi terhadap komponen yang mempunyai massa molekul relatif (Mr) yang tinggi dan fasa padat tersebut dimiliki oleh gel atau sejenisnya sedangkan fasa geraknya adalah cairan. Kromatografi dengan dasar filtrasi ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk (struktur dan ukuran molekul).

1. Kromatografi dengan asas suhu kritik.

Pada dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi gas, sebagai fasa mobil dipakai CO₂ dalam keadaan superkritik.
Secara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya sehingga terjadi keseimbangan yang baik antara fase gerak dan fase diam. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi yang terjadi sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, maka penjerap atau fase diam harus berupa serbuk halus. Sedangkan untuk memaksa fase gerak bergerak cepat melalui fase diam yang berupa serbuk halus, harus digunakan tekanan tinggi. Persyaratan tersebut menghasilkan teknik high pressure liquid chromatography, yang selanjutnya lebih dikenal sebagai high performance liquid chromatography (HPLC) atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter et al., 1991).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode pemisahan yang dikembangkan dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas yaitu proses pemisahan yang berdasarkan afinitas, filtrasi gel, dan ion yang berpasangan yang prosesnya tetap dilaksanakan di dalam kolom yang disertai pemakaian pelarut dengan tekanan tinggi (Mulja,1995).
HPLC adalah teknik yang berkembang dari kromatografi kolom yang memiliki beberapa keuntungan diantaranya ukuran fasa diamnya lebih kecil, kolom lebih pendek sehingga waktu elusi atau waktu retensi (t_R) lebih pendek dan analisisnya berlangsung cepat, pelarut dan kolom dapat dipakai berulang kali serta ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi. Apabila dibandingkan dengan  kromatografi gas maka HPLC tidak dipengaruhi oleh volatilitas dan stabilitas bahan (Lindsay, 1992).
Dasar pemisahan HPLC adalah perbedaan kecepatan migrasi dari komponen-komponen sampel yang terjadi karena adanya perbedaan kesetimbangan distribusi dalam fasa diam dan fasa gerak untuk senyawa-senyawa yang berbeda. HPLC sangat ideal untuk memisahkan molekul-molekul dari sampel organik dalam sampel biologis, bahan-bahan alam yang mudah mengalami perubahan, senyawa yang kurang stabil, dan senyawa dengan berat molekul tinggi (Mulja, 1995; Lindsay, 1992).
HPLC pada dasarnya adalah suatu bentuk kromatografi kolom yang menggunakan kolom yang terbuat dari bahan kemasan ukuran partikel kecil dan berbentuk teratur. Karena kehalusan kemasan, untuk mendapatkan laju aliran yang memadai, digunakan tekanan sampai 10.000 psi. Cara ini memungkinkan peneliti menganalisis komponen flavonoid dalam suatu campuran secara kuantitatif pada aras resolusi dan kepekaan yang tinggi (< 50 ng) (Markham, 1987).
Dalam HPLC, terdapat suatu detektor yang sangat peka untuk menganalisis larutan yang keluar dari kolom. Secara umum, alat yang digunakan untuk deteksi dalam kromatografi kolom berdasarkan pada perbedaan sifat fisika dan kimia dari analit dan pelarut. Pada sistem kromatografi cair, sifat fisik dari sampel dan fase gerak sering kali sama sehingga ada 2 tipe dasar detektor yang dikembangkan untuk penggunaan pada sistem kromatografi cair, yaitu: 1). Mengukur perbedaan sifat umum yang ada baik pada sampel maupun fase gerak, misalnya detektor perbedaan indeks bias, konduktivitas dan konstanta dielektrik; 2). Mengukur sifat yang spesifik pada sampel, dengan membersihkan fase gerak sebelum deteksi (flame ionization detector (FID) dan electron capture detector (ECD)) atau tanpa membersihkan fase gerak sebelum deteksi dilakukan (detektor UV, polarografi dan radioaktivitas). Karakteristik detektor yang ideal  untuk HPLC, antara lain: memiliki sensitivitas tinggi, memberikan respon terhadap semua solut (memiliki spesifisitas yang dapat diprediksi), memiliki respon linier terhadap seri konsentrasi solut, ruang kosong yang rendah, tidak destruktif, tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan fase gerak, dan mudah digunakan (Hamilton et al., 1982; Swadesh, 2000).
Dalam penggunaan HPLC, ada 2 teknik yang sering dilakukan yaitu elusi secara isokratik dan gradien. Kromatografi isokratik cenderung lebih sensitif terhadap perubahan fase gerak, temperatur, kecepatan pompa dan komposisi sampel. Sedangkan kromatografi gradien biasanya kurang sensitif terhadap variasi kecil faktor-faktor diatas, tetapi sangat sensitif terhadap kolom, waktu ekuilibrasi dan preparasi gradien. Parameter teoritis dari kromatografi isokratik digambarkan dengan model lempeng (plate). Senyawa yang dianalisis akan terdistribusi antara fase diam dan fase gerak. Pada saat tertentu, suatu molekul akan ditransfer pada fase diam dalam kolom. Kemudian, molekul tersebut akan lepas dari kolom dan terbawa kembali oleh fase gerak sampai pada tempat dimana molekul tersebut terikat lagi pada fase diam. Proses ini terjadi secara kontinyu. Lokasi dimana analit ditransfer ke fase diam secara teoritis disebut lempeng (plate) dan jarak antara lempeng satu dengan yang lain disebut tinggi lempeng (plate height). Parameter yang digunakan untuk menentukan kemampuan pemisahan dalam penggunaan HPLC adalah faktor kapasitas, waktu retensi, lebar pada tinggi setengah puncak, jumlah lempeng teoritis, resolusi dan  faktor selektivitas (Swadesh, 2000).

from netsains.com

Posted in: sains